小鼠子宫平滑肌细胞实验操作步骤

细胞传代与冻存

当原代细胞生长至80%-90%融合时，即可进行传代。弃去培养液，用预冷的PBS轻柔冲洗两次，加入0.25%（含0.02%EDTA）消化1-2分钟。在倒置显微镜下观察细胞回缩变圆后，立即加入含血清的培养基终止消化，用移液管轻柔吹打成单细胞悬液。以1000rpm离心5分钟后，按1:2或1:3比例传代至新的培养瓶中。

对于细胞冻存，取对数生长期细胞，按常规方法消化后计数，用含10%DMSO的培养基重悬细胞至1×10⁶/mL，分装至冻存管中，采用程序降温盒进行梯度降温（4℃30min→-20℃2h→-80℃过夜），最后转移至液氮中长期保存。

功能实验设计

（1）收缩功能检测：可采用胶原凝胶收缩实验，将细胞与胶原混合后接种于24孔板，待凝胶形成后观察收缩情况；或使用微流控芯片模拟三维收缩环境。

（2）钙成像实验：加载Fluo-4 AM钙离子荧光探针后，通过共聚焦显微镜实时记录细胞内钙瞬变，分析激动剂（如催产素）刺激下的钙信号变化。

（3）电生理研究：采用膜片钳技术记录细胞膜电位及离子通道电流，特别注意大电导钙激活钾通道（BKCa）的特征性电流。

数据收集与分析

所有实验需设置至少3个生物学重复。收缩实验数据建议采用ImageJ软件量化凝胶面积变化；钙信号数据使用Clampfit或Igor Pro进行峰值分析；电生理数据需校正电容电流。统计方法推荐采用Student's t检验（两组比较）或单因素方差分析（多组比较），显著性水平设为p<0.05。

‌注意事项：

1. 子宫平滑肌细胞对机械刺激敏感，所有操作需动作轻柔

2. 原代细胞建议在3-5代内完成实验以保证表型稳定

3. 功能实验前需进行α-SMA免疫荧光鉴定（纯度应>90%）

4. 不同动情周期获取的细胞可能存在功能差异，需记录动物生理状态